dePAT-CVPD merupakan kit deteksi cepat penyakit CVPD (Citrus Vein Phloem Degeneration) atau HLB (Huanglongbing) tanaman jeruk merupakan salah satu teknologi inovatif hasil penelitian peneliti Balitjestro (Ir. Nurhadi, M.Sc dan Yunimar, S.Si, M.Si) Badan Litbang Pertanian yang dikembangkan sebagai solusi alternatif untuk memudahkan, mempercepat dan menyederhanakan prosedur dalam sistem deteksi penyakit CVPD di lapang, sehingga hasil deteksi dapat segera di konfirmasi. Karena fiturnya yang cepat, akurat dan udah diaplikasikan, kit ini sesuai untuk dikembangkan dengan plat form loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) suatu teknik ampifikasi DNA secara isotherma yang diintroduksikan oleh Notomi pada tahun 2000.

Prinsip kerja LAMP didasarkan pada penggunaan empat sampai enam set primer untuk mengenali enam sampai delapan sekuen target DNA melalui sintesis perpindahan untai DNA secara isothermal dengan memanfaatkan peran enzim DNA polymerase untuk mendeteksi sekuens target DNA spesifik penyebab penyakit. Amplifikasi dilakukan dengan perangkat sederhana pada suhu antara 63 sampai 65⁰C selama 45-60 menit untuk menghasilkan DNA dalam jumlah besar sehingga mempermudah dalam interpretasi hasilnya.

Kit dePAT-CVPD terdiri dari tiga komponen yang masing-masing disiapkan dalam keasan siap pakai : 1) Buffer ekstraksi DNA yang dikemas dalam kantong plastik, 2) campuran reaksi LAMP yang dikemas dalam bentuk kering beku, 3) buffer reconstitute yang dikemas dalam boto plastik. Interpretasi hasil amplifikasi dapat dilakukan secara real time menggunakan flourimeter atau dengan mengamati secara visual terhadap perubahan warna.

Keunggulan dePAT-CVPD antara lain :

1. Cepat, proses deteksi berlangsung (60-75 menit) sejak persiapan sampe sampai interpretasi hasil.
2. Spesifik, hanya mendeteksi sekuen DNA target (CVPD).
3. Sensitif, mampu mendeteksi sampai DNA target (CVPD) sampai level 10 picogram.
4. Mudah, protokolnya sederhana dan aplikasinya tidak memerlukan keahlian khusus.
5. Murah, tidak memerlukan fasilitas laboratorium khusus dan peralatan yang canggih dan mahal.

Prosedur Deteksi Cepat Penyakit CVPD

a. Pemilihan Sampel

Sampel dikumpukan dari daun tanaman jeruk pada tunas vegetatif yang sedang dalam fase pertumbuhan aktif. 5 (lima) lembar daun dimasukkan dalam kantong plastik, diberi label dan disiapkan sebagai bahan yang akan didiagnosis.

b. Ekstraksi Sampel DNA

Pangkal tulang daun (midrib) diiris-iris tipis berukuran 5 mm sebanyak 12 potong (± 50 mg), kemudian dimasukkan dalam kantong plastik yang berisi buffer BA. Potongan midrib digerus sampai halus menggunakan penggerus berujung tumpul sampai halus. Dua puluh lima µL cairan sampe dalam buffer BA dipindahkan pada kantong plastik yang sebelumnya berisi buffer BE. Sampel dihomogenisasi dengan menekan beberapa kali permukaan kantong plastik. Sampel siap digunakan untuk dianalisis.

c. Preparasi Campuran Reaksi

Merekonstituse tabung berisi campuran reaksi dengan menambahkan 20 µL buffer rekonstitusi. Menambahkan 5 µL sampel yang telah dipreparasi. Memasukan tabung yang telah berisi sampel dalam pemanas air yang suhunya telah mencapai 65⁰ C selama 45-60 menit.

d. Amplifikasi DNA

Menyiapkan  air panas dalam pemanas air yang suhunya diatur sampai mencapai 65⁰ C. Memanaskan preparasi sampe daam tabung ke dalam pemanas air selama 45-60 menit. Proses ini dilanjutkan (optional) dengan meningkatkan suhu air sebesar 95⁰ C selama 2 menit. Segera setelah proses pemanasan selesai, tabung dikeluarkan dari pemanas air untuk diamati dan diinterpretasi.

e. Visualisasi Hasil Amplifikasi

Visualisasi hasil amplifikasi dapat diakukan dengan berbagai cara :

1. Fluorometer. Sampel positif ditandai dengan meningkatnya % fluoresensi.
2. Agar gel electrophoresis. Sampel positif ditandai dengan terbentuknya pita DNA mirip tangga (ladder-like) pada agar.
3. Pewarna Sybrgreen. Sampel positif ditandai dengan terjadinya perubahan warna dari kuning kecoklatan (negatif) menjadi hijau flourescens (positif)
4. Pewarna calcein. Sampel positif ditandai dengan terjadinya perubahan warna dari kuning warna kuning (negatif) menjadi hijau fluorescens (positif)
5. Pewarna Hydronapthol Blue. Sampel positif ditandai dengan terjadinya perubahan warna dari ungu (negatif) menjadi biru muda (positif)

f. Interpretasi Hasil

Hasil amplifikasi dapat dideteksi melalui berbagai cara :

1. Secara real-time dengan menggunakan pewarna interkalasi fluoresensi seperti SYBR green.
2. Penggunaan agar gel melalui elektrophoresis
3. Mengukur tingkat kekeruhan hasil reaksi amplifikasi sebagai produk sampingan pada dasar tabung melalui fotometri.
4. Mengamati secara visual terjadinya perubahan warna yang bisa dilihat dengan mata telanjang tanpa perlu peralatan mahal.

Diambil dari Materi Workshop Inovasi Teknologi dan Produk Unggulan Jeruk (Balitjestro, Batu 30-31 Agustus 2017)